TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8342 : 2010

THUỶ SẢN VÀ SẢN PHẨM THUỶ SẢN ( PHÁT HIỆN SALMONELLA

BẰNG KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERAZA (PCR)

Fish and fishery products - Detection of Salmonella using Polymerase Chain Reaction (PCR) technique

Lời nói đầu

TCVN 8342 : 2010 do Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR).

2. Nguyên tắc

Phương pháp này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích (một đoạn trong gen invA) có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agaroza, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn cực tím (UV) ở bước sóng 302 nm. Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích.

CHÚ THÍCH: Tất cả các kiểu huyết thanh Salmonella đều mang cụm gen inv (invasion) giúp cho quá trình xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật, mở đầu của tiến trình gây bệnh. Cụm gen này nằm trong hệ thống gen SPI-1 (Salmonella pathogenicity island) có mặt trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hoá thấp nhất là S. bongori đến nhóm tiến hoá cao nhất là S. enterica I. InvA là một bản gen luôn có mặt trong hệ thống gen inv.

3. Thuốc thử, môi trường và vật liệu

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, nước được sử dụng là nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1 Cặp mồi

Gồm hai mồi invA1 và invA2 được thiết lập cách nhau 520 bp trong gen invA có vai trò trong quá trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và người. Trình tự của hai mồi như sau:

invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3';

invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3'.

Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 6 pM trong đệm TE. Đệm TE có thành phần như sau: 10 mM Tris-HCl (pH = 8) và 1 mM EDTA.

3.2 Môi trường nuôi cấy

Khuyến khích sử dụng môi trường nuôi cấy dạng bột khô và các vật liệu dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành kit đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp như dưới đây.