TIÊU CHUẨN NGÀNH

28 TCN 199:2004

SALMONELLA TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH BẰNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION

Salmonella in fishery products - Method for qualitative analysis by Polymerase Chain Reaction

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (sau đây gọi tắt là PCR).

2. Tài liệu tham khảo

- Rapid Identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of virulence gens, invA and spvC, by an Enrichment broth culture multiplex PCR combination assay. (CHENG HSUN CHIU AND JONATHAN T.OU. - Journal of Clinical microbiology, p.2619-2622. Oct. 1996).

- Specific detection of Salmonella spp. by multiplex polymerase chain reaction. (JS. WAY, KL. JOSEPHSON, SD. PILLAI, M. ABBASZADAGAN, CP. GERBA AND IL. PEPPER. - Appl. Environ. Microbiol., 59 (5) : 1473 - 1479, 1993).

- Detection of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in Suspended Organic Waste by Nucleic Acid Extraction and PCR. (CAROLA BURTSCHER, PAPA A. FALL, PETER A. WILDERER, AND STEFAN WUERTZ. - Appl. Environ. Microbiol. 65 (5): 2235 - 2237, 1999).

- Nordic commitees on food analysis (NMKL) No 71, 5^th ed., 1999, Salmonella - Detection in foods.

3. Giải thích thuật ngữ

Trong Tiêu chuẩn này, các thuật ngữ dưới đây được hiểu như sau :

3.1 Salmonella

Giống Salmonella là vi sinh vật thuộc họ vi khuẩn đường ruột enterobacteriaceae có hơn 2400 kiểu huyết thanh.Salmonella là trực trùng Gram âm, kích thước khoảng 0,6 - 2,0 mm, hiếu khí, có thể di động, không tạo bào tử, sinh hơi lên men dextrosa, sinh khí đihyđrosunfua.

Tất cả các khiểu huyết thanh Salmonella đều mang cụm gen inv (invasion) giúp cho quá trình xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật, mở đầu của tiến trình gây bệnh. Cụm gen này nằm trong hệ thống gen SPI - 1 (Salmonella pathogenicity island) có mặt trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hoá thấp nhất là S. bongori đến nhóm tiến hoá cao nhất là S. enterica I. InvA là một bản gen luôn có mặt trong hệ thống gen inv.

3.2 Kỹ thuật PCR là kỹ thuật dùng để khuếch đại số lượng bản sao của một trình tự AND đích qua các chu kỳ gồm 3 bước: biến tính ADN, bắt cặp bổ sung với mồi và tổng hợp mạch mới nhờ enzym ADN polymerase.

3.3 ADN đích (target ADN)

Trong kỹ thuật PCR, ADN đích được hiểu là một đoạn ADN đặc trưng cho đối tượng cần phát hiện. Trong Tiêu chuẩn này, ADN đích là một đoạn trong gen invA.

3.4 Biến tính là sự chuyển từ sợi ADN dạng mạch kép sang dạng mạch đơn dưới tác dụng của tác nhân biến tính. Trong Tiêu chuẩn này, tác nhân biến tính là nhiệt.

3.5 Bắt cặp bổ sung là sự kết hợp giữa hai mạch ADN hay một ADN mạch đơn với ARN có các trình tự bổ sung để tạo nên một mạch kép.

3.6 ADN polymerase là enzym tổng hợp nên mạch ADN mới từ một mạch khuôn. Phương pháp này sử dụng Taq ADN polymerase là một ADN polymerase hoạt động ở nhiệt độ cao.

3.7 Mồi là một trình tự ADN hay ARN ngắn bắt cặp với một mạch khuôn ADN có mang một đầu 3' - OH tự do giúp ADN polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới.

4. Nguyên tắc

Phương pháp định tính này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agarose, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn UV có bước sóng là 302 mm. Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích.

5. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất và môi trường

5.1 Thiết bị, dụng cụ

5.1.1 Tủ ấm 37^oC.

5.1.2 Máy luân nhiệt.

5.1.3 Máy ly tâm dùng cho ống eppendorf 1,5 ml.

5.1.4 Máy lắc ống nghiệm.

5.1.5 Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di có điện thế hoạt động từ 80 đế 150 volt.

5.1.6 Hộp đèn soi UV có kính lọc 302mm.

5.1.7 Bộ chụp ảnh trên đèn UV.

5.1.8 Ống Eppendorf 0,2. 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR.

5.2 Hoá chất, môi trường

5.2.1 Mồi

Gồm hai mồi invA1 và invA2 được thiết lập cách nhau 520 bp trong gen invA có vai trò trong quá trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và người. Trình tự của hai mồi như sau :