Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13263-11:2021 về Phân bón - Phần 11: Xác định hàm lượng chitosan bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử được Bộ Khoa học và Công nghệ công bố năm 2021, ban hành nhằm quy định quy trình kỹ thuật chuẩn hóa để xác định chính xác hàm lượng chitosan trong các sản phẩm phân bón bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis).

Phạm vi áp dụng và đối tượng điều chỉnh

Tiêu chuẩn này áp dụng đối với các cơ quan quản lý nhà nước, tổ chức chứng nhận hợp quy, phòng thử nghiệm và các doanh nghiệp sản xuất, nhập khẩu, kinh doanh phân bón tại Việt Nam. Phạm vi điều chỉnh cụ thể bao gồm:

• Quy định phương pháp xác định hàm lượng chitosan trong các loại phân bón có chứa hoạt chất này, bao gồm cả phân bón dạng rắn và phân bón dạng lỏng.
• Thiết lập các yêu cầu kỹ thuật về thiết bị, hóa chất, quy trình chuẩn bị mẫu, tiến hành đo đạc và tính toán kết quả phân tích nhằm bảo đảm tính đồng nhất và độ chính xác cao.

Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, các phòng thử nghiệm cần viện dẫn và tuân thủ tài liệu kỹ thuật sau:

• TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng cho phòng thí nghiệm phân tích - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

Nguyên lý của phương pháp xác định

Phương pháp xác định hàm lượng chitosan dựa trên nguyên lý hóa lý nghiêm ngặt sau:

• Chitosan trong mẫu phân bón được hòa tan và chiết xuất bằng dung dịch axit thích hợp (thường là axit axetic loãng).
• Sau khi chiết xuất, chitosan phản ứng với thuốc thử màu chuyên dụng (Cibacron Brilliant Red 3B-A) trong môi trường đệm axit thích hợp để tạo thành một phức chất màu bền vững.
• Độ hấp thụ quang của phức chất màu hoặc độ giảm độ hấp thụ quang của thuốc thử được đo bằng máy quang phổ hấp thụ phân tử ở bước sóng cực đại khoảng 575 nm.
• Hàm lượng chitosan trong mẫu được tính toán dựa trên đường chuẩn được xây dựng từ dung dịch chitosan chuẩn với các nồng độ đã biết trước.

Hóa chất, thuốc thử và thiết bị dụng cụ

Tiêu chuẩn quy định nghiêm ngặt về chất lượng hóa chất và thiết bị sử dụng để đảm bảo độ lặp lại và độ tái lập của kết quả phân tích:

• Hóa chất và thuốc thử: Chỉ sử dụng các hóa chất có độ tinh khiết phân tích và nước dùng trong phòng thí nghiệm phù hợp với TCVN 4851 (ISO 3696), loại 3 hoặc có độ tinh khiết tương đương. Các hóa chất chính bao gồm: Chitosan chuẩn (có hàm lượng và độ khử axetyl rõ ràng); Axit axetic băng; Axit clohydric (HCl); Glycine; Thuốc thử màu Cibacron Brilliant Red 3B-A; Dung dịch đệm glycine-HCl (pH khoảng 2,5).
• Thiết bị và dụng cụ: Máy quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) có khả năng đo ở bước sóng 575 nm, trang bị cuvet thạch anh hoặc cuvet thủy tinh có chiều dày truyền quang 10 mm; Máy lắc hoặc thiết bị khuấy từ; Máy ly tâm có tốc độ quay tối thiểu 4000 vòng/phút; Cân phân tích có độ chính xác đến 0,0001 g; Các dụng cụ thủy tinh thông thường trong phòng thí nghiệm như bình định mức, pipet tự động, cốc mỏ đã được hiệu chuẩn.

Quy trình chuẩn bị mẫu và tiến hành thử nghiệm

Quy trình thực hiện phải tuân thủ các bước kỹ thuật chặt chẽ nhằm loại bỏ sai số:

• Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Hòa tan một lượng chitosan chuẩn chính xác trong dung dịch axit axetic loãng để thu được dung dịch gốc. Từ dung dịch gốc, tiến hành pha loãng bằng dung dịch đệm để thiết lập dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần nhằm vẽ đường chuẩn.
• Xử lý mẫu thử: Cân một lượng mẫu phân bón xác định (tùy thuộc vào hàm lượng chitosan dự kiến trong mẫu). Đối với mẫu rắn, cần nghiền nhỏ và đồng nhất hóa. Hòa tan mẫu bằng dung dịch axit axetic, lắc đều trong một khoảng thời gian quy định để chiết xuất hoàn toàn chitosan. Ly tâm hoặc lọc lấy phần dung dịch trong để tiến hành phản ứng tạo màu.
• Phản ứng tạo màu và đo quang: Hút một thể tích dung dịch mẫu thử đã xử lý và các dung dịch chuẩn vào các bình định mức riêng biệt. Thêm dung dịch đệm và dung dịch thuốc thử Cibacron Brilliant Red 3B-A theo đúng tỷ lệ quy định. Định mức bằng nước cất, lắc đều và để yên trong bóng tối khoảng 20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra hoàn toàn. Tiến hành đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 575 nm so với mẫu trắng.

Tính toán kết quả và độ chụm

Kết quả phân tích được xử lý thông qua các công thức toán học và yêu cầu về độ sai số cho phép:

• Hàm lượng chitosan (tính bằng phần trăm khối lượng hoặc mg/kg) được tính toán dựa trên phương trình đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa độ hấp thụ quang và nồng độ chitosan.
• Công thức tính toán có tính đến các hệ số pha loãng, khối lượng mẫu thử và độ ẩm của mẫu (nếu cần quy về chất khô).
• Độ lặp lại (r) và độ tái lập (R): Chênh lệch giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập được tiến hành trên cùng một mẫu thử, bởi cùng một kiểm nghiệm viên, sử dụng cùng một thiết bị trong một khoảng thời gian ngắn không được vượt quá giới hạn cho phép quy định trong tiêu chuẩn.

Hiệu lực thi hành

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13263-11:2021 có hiệu lực kể từ ngày công bố. Tiêu chuẩn này đóng vai trò là căn cứ kỹ thuật pháp lý quan trọng cho việc kiểm tra chất lượng, chứng nhận hợp quy và thanh tra nhà nước đối với các sản phẩm phân bón chứa hoạt chất sinh học chitosan lưu thông trên thị trường Việt Nam.