Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13516:2022 về Thức ăn chăn nuôi - Phân lập và định lượng các chủng nấm men probiotic được ban hành nhằm thiết lập một phương pháp chuẩn hóa, thống nhất trên phạm vi cả nước để xác định mật độ các chủng nấm men probiotic (chủ yếu là các chủng thuộc loài Saccharomyces cerevisiae) có trong các sản phẩm thức ăn chăn nuôi và phụ gia thức ăn chăn nuôi.

Phạm vi và đối tượng áp dụng của tiêu chuẩn

TCVN 13516:2022 áp dụng đối với tất cả các tổ chức, cá nhân tham gia vào hoạt động sản xuất, kinh doanh, nhập khẩu, kiểm nghiệm và quản lý chất lượng thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam. Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phân lập và định lượng nấm men probiotic trong các dạng sản phẩm bao gồm:

• Các loại thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm và thủy sản.
• Thức ăn đậm đặc và thức ăn bổ sung.
• Các chế phẩm premix (premix vitamin, premix khoáng có chứa nấm men).
• Các chất phụ gia thức ăn chăn nuôi dạng đơn chất hoặc hỗn hợp chứa nấm men probiotic hoạt động.

Các nội dung kỹ thuật cốt lõi của TCVN 13516:2022

1. Nguyên tắc của phương pháp phân lập và định lượng

• Phương pháp dựa trên kỹ thuật đếm khuẩn lạc (colony-count technique) ở điều kiện hiếu khí.
• Mẫu thử được hòa tan và pha loãng theo dãy thập phân trong dung dịch đệm thích hợp để thu được các nồng độ loãng phân tích.
• Tiến hành cấy mẫu đã pha loãng lên môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc, sau đó ủ ở nhiệt độ 30 độ C trong khoảng thời gian từ 48 giờ đến 72 giờ để nấm men phát triển thành các khuẩn lạc có thể quan sát bằng mắt thường.

2. Thiết bị, dụng cụ và môi trường nuôi cấy

• Tiêu chuẩn yêu cầu sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm vi sinh tiêu chuẩn như tủ ấm duy trì nhiệt độ ổn định ở 30 độ C, máy dập mẫu (stomacher) hoặc máy lắc trộn để đồng nhất mẫu, cân phân tích có độ chính xác cao, kính hiển vi quang học và các dụng cụ thủy tinh vô trùng.
• Môi trường nuôi cấy được chỉ định cụ thể là môi trường thạch chiết xuất nấm men - glucose - chloramphenicol (CGYE) hoặc môi trường thạch tương đương có bổ sung chất kháng sinh để ức chế sự phát triển của vi khuẩn, đảm bảo chỉ có nấm men phát triển.

3. Quy trình chuẩn bị mẫu và tiến hành thử nghiệm

• Chuẩn bị mẫu thử: Tiến hành cân một lượng mẫu đại diện xác định (thường là 25g hoặc 10g) trong điều kiện vô trùng, sau đó hòa loãng với dung dịch pha loãng peptone muối hoặc dung dịch đệm phosphat theo tỷ lệ 1:10. Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong thời gian quy định để giải phóng hoàn toàn các tế bào nấm men từ thể nền của thức ăn.
• Pha loãng thập phân: Từ dung dịch huyền phù ban đầu, tiếp tục thực hiện các bước pha loãng bậc mười tiếp theo (10^-2, 10^-3,...) tùy thuộc vào mật độ nấm men dự kiến có trong mẫu.
• Cấy mẫu và ủ ấm: Sử dụng phương pháp cấy trải trên bề mặt thạch hoặc cấy chìm (đổ đĩa). Sau khi thạch đông, lật ngược các đĩa thạch và đưa vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 độ C. Theo dõi và ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc sau 48 giờ và tối đa là 72 giờ.

4. Tính toán và biểu thị kết quả

• Chọn các đĩa thạch có số lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng tối ưu (thường từ 10 đến 300 khuẩn lạc) để tiến hành đếm.
• Xác nhận các khuẩn lạc nấm men đặc trưng thông qua hình thái học khuẩn lạc (màu sắc, độ đục, bề mặt) và kiểm tra dưới kính hiển vi nếu cần thiết để phân biệt với các loại nấm mốc hoặc tạp khuẩn khác.
• Sử dụng công thức tính toán tiêu chuẩn để xác định số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên một gam (g) hoặc một mililit (ml) mẫu thức ăn chăn nuôi ban đầu, có tính đến hệ số pha loãng và thể tích dịch cấy.

5. Báo cáo thử nghiệm

• Báo cáo kết quả phải thể hiện đầy đủ các thông tin bao gồm: phương pháp lấy mẫu, phương pháp thử nghiệm áp dụng (viện dẫn TCVN 13516:2022), kết quả định lượng cuối cùng biểu thị dưới dạng số mũ cơ số 10 (ví dụ: CFU/g), và mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn hoặc được coi là tùy chọn nhưng có ảnh hưởng đến kết quả.

Hiệu lực thi hành và hướng dẫn áp dụng

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13516:2022 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày được cơ quan có thẩm quyền công bố ban hành. Việc áp dụng tiêu chuẩn này giúp các phòng thử nghiệm nâng cao năng lực kiểm soát chất lượng, hỗ trợ các doanh nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi tự công bố chất lượng sản phẩm chính xác, đồng thời phục vụ đắc lực cho công tác thanh tra, kiểm tra chuyên ngành của các cơ quan quản lý nhà nước về nông nghiệp và phát triển nông thôn.